Разработан метод манипуляции иммунными T-клетками, способный помочь в лечении ВИЧ
Т-клетки CD4+ являются важной частью иммунной системы и играют ключевую роль в защите организма от патогенов. Поскольку в состоянии покоя они обладают большим количеством защитных механизмов против ВИЧ, они инфицируются очень редко - но эти несколько инфицированных клеток образуют латентный резервуар для ВИЧ в организме, до которого в настоящее время не могут добраться противовирусные препараты.
Следовательно, после активации CD4+ Т-клеток вирус может снова распространиться оттуда. Понимание того, как ВИЧ взаимодействует с покоящимися CD4+ Т-клетками, необходимо для поиска новых терапевтических подходов. Ученые под руководством профессора Оливера Т. Кепплера из Института Макса фон Петтенкофера при LMU разработали метод, который впервые позволяет эффективно и без особых сложностей генетически манипулировать этими специфическими иммунными клетками в физиологических условиях. Как сообщают авторы в журнале Nature Methods, это позволяет получить ранее недостижимое представление о биологии этих клеток.
Покоящиеся CD4+ Т-клетки практически не поддавались генетическим манипуляциям, поскольку имеющиеся методы обычно предполагают наличие делящихся клеток, как объясняет Кепплер.
В качестве первого шага в разработке нового метода команда ученых оптимизировала условия культивирования. В результате исследователи смогли поддерживать жизнь этих клеток в лаборатории после извлечения их из крови здоровых доноров не 3-4 дня, как раньше, а до шести недель. Решающий прогресс был достигнут благодаря нуклеофекции - специальному методу, позволяющему доставлять реагенты в ядро клетки.
Используя этот метод, исследователи ввели генетические ножницы CRISPR-Cas в покоящиеся CD4+ Т-клетки, что позволило им вносить целевые изменения в геном клеток-хозяев - например, удалять гены с помощью так называемых нокаутов.
"Эта комбинация сработала очень эффективно, и мы смогли достичь и генетически манипулировать примерно 98 процентами клеток. Более того, мы сделали это без активации CD4+ Т-клеток", - сказал Кепплер. "Особенно интересным было то, что мы смогли одновременно устранить до шести генов с высокой эффективностью с помощью одной нуклеофекции. До этого никому не удавалось сделать это в первичных клетках, а мы сделали это с клетками, выделенными из интактного органа".
В будущем исследователи смогут удалять отдельные гены и целые сигнальные пути и анализировать их функции. Выбивая соответствующие гены, им уже удалось выяснить, играют ли четыре ранее спорных клеточных фактора роль в заражении ВИЧ или нет.
Кроме того, они применили второй подход "нок-ин", при котором вставляются дополнительные или слегка измененные гены, например, ген зеленого флуоресцентного белка (GFP). С помощью этого белка исследователи могут анализировать, как изменяется активность целевого гена в определенных условиях, или помечать конкретные белки.
"Все это вместе дает нам возможность впервые исследовать взаимодействие ВИЧ с покоящимися CD4+ Т-клетками человека в физиологических условиях", - объясняет Адриан Руле, соруководитель исследования. "Но мы также можем лучше изучить эти клетки в их общей роли иммунных клеток помимо ВИЧ". В долгосрочной перспективе исследователи надеются, что лучшее понимание биологии этих клеток приведет к новым подходам для полного удаления ВИЧ из организма пациентов, поскольку в мире все еще насчитывается около 37 миллионов человек, инфицированных этим вирусом.
